發(fā)布時(shí)間: 2025-06-26 點(diǎn)擊次數(shù): 22次
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)作為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù),通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合與酶催化顯色反應(yīng),實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)、激素、細(xì)胞因子等生物分子的高靈敏度定量檢測(cè)。其核心原理基于抗原與抗體的“鎖鑰”識(shí)別機(jī)制,結(jié)合酶催化底物顯色的信號(hào)放大效應(yīng),將微量生物分子轉(zhuǎn)化為可量化的光學(xué)信號(hào)。
1.包被抗原/抗體
將特異性捕獲抗體或抗原用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至1-10μg/mL,加入96孔酶標(biāo)板中,每孔100μL,4℃孵育過(guò)夜或37℃孵育2小時(shí)。此步驟使抗原/抗體通過(guò)疏水作用固定于固相載體表面,形成捕捉層。
2.封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)
加入5% BSA或脫脂奶粉封閉液,每孔200μL,室溫孵育1-2小時(shí),以減少后續(xù)步驟中非特異性吸附導(dǎo)致的背景噪聲。
3.加樣與孵育
將待測(cè)樣本稀釋至適當(dāng)濃度(如1:100),每孔加入100μL,37℃孵育1-2小時(shí)。樣本中的目標(biāo)分子與固相載體上的捕獲抗體/抗原特異性結(jié)合,形成抗原-抗體復(fù)合物。
4.酶標(biāo)抗體結(jié)合
加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體,每孔100μL,37℃孵育1小時(shí)。該抗體與目標(biāo)分子的另一表位結(jié)合,形成“夾心”結(jié)構(gòu)。
5.顯色與終止
加入TMB顯色液,每孔100μL,室溫避光孵育10-30分鐘。HRP催化TMB氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物,加入2M硫酸終止反應(yīng)后,溶液轉(zhuǎn)為黃色。
6.結(jié)果讀取
使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(OD值),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算樣本濃度。
二、技術(shù)亮點(diǎn):高靈敏度與高特異性的雙重保障
ELISA的靈敏度可達(dá)皮摩爾級(jí)別,這得益于酶催化反應(yīng)的信號(hào)放大效應(yīng)。例如,在雙抗體夾心法中,單個(gè)目標(biāo)分子可結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)抗體,顯著提升顯色強(qiáng)度。其特異性則源于抗原抗體的精準(zhǔn)識(shí)別,通過(guò)優(yōu)化抗體對(duì)的選擇與孵育條件,可有效避免交叉反應(yīng)。

三、應(yīng)用場(chǎng)景:從臨床診斷到科研探索
ELISA廣泛應(yīng)用于病毒抗原檢測(cè)(如新冠病毒IgM/IgG抗體)、藥物殘留篩查(如牛奶中青霉素殘留)及細(xì)胞因子定量(如IL-6在炎癥研究中的應(yīng)用)。其高通量、低成本的特性,使其成為生物醫(yī)學(xué)研究至關(guān)重要的工具。
從包被到顯色,ELISA的每一步操作均需嚴(yán)格遵循科學(xué)規(guī)范。唯有如此,方能將這一技術(shù)轉(zhuǎn)化為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步的可靠力量。